La búsqueda de un ensayo de citotoxicidad verdaderamente confiable para perfluorocarbonos líquidos (PFCL) se está convirtiendo en uno de los temas «más candentes» en la cirugía vitreorretiniana.

A partir de los eventos muy desafortunados ocurridos durante los últimos años con el uso de perfluorocarbonos líquidos para tamponamiento ocular, los cirujanos quieren estar seguros de que estos incidentes no volverán a ocurrir. Con este objetivo, los fabricantes de PFCL se comprometen seriamente a hacer todo lo posible para proporcionar a los cirujanos evidencias sólidas sobre la seguridad de sus productos.

Está comprobado que los productos PFCL no reactivos y completamente fluorados como el PFO (perfluoro-n-octano) y PFD (perfluorodecalina) no son tóxicos por sí mismos; por lo tanto, todos los esfuerzos de investigación se centran ahora en la búsqueda de los mejores atributos de proyecto para detectar o, más adecuadamente, excluir la presencia de impurezas que puedan conducir a la toxicidad ocular.

Sin embargo, la literatura más reciente demuestra claramente que este tema aún es objeto de un gran debate y que falta un acuerdo general en este campo.

Actualmente, dos enfoques diferentes están en el centro de la atención: la determinación del valor H y las pruebas de citotoxicidad in vitro utilizando métodos de contacto directo.

El grupo de investigación de Menz de Pharmpur Gmbh, mientras que destacaba la relevancia clínica del así llamado valor H, definido como la cantidad residual de compuestos incompletamente fluorados en los PFCL, propuso que “El valor H es una medida para las impurezas reactivas y subfluoradas que causan toxicidad de los PFCL y deben incorporarse en cada especificación de los endotampones con un límite de 10 ppm para demostrar la efectividad de la ultrapurificación requerida y garantizar un producto seguro«. La propuesta se basó en la «evidencia de que […] los derivados subfluorados que surgen inevitablemente durante la producción y se disuelven en PFCL pueden, incluso en cantidades mínimas, ocasionalmente ocasionar reacciones tóxicas severas» y que «la reactividad de los compuestos subfluorados y su toxicidad están estrechamente relacionadas”.

Las dudas surgidas sobre la determinación del contenido de H incluyeron, entre otras cosas, su capacidad para detectar sólo compuestos subfluorados específicos (que tienen enlaces C-H) mientras dejan sin detectar otros compuestos químicos potencialmente tóxicos – que se identificaron en el PFCL «inseguro» utilizado en España, como ácidos, alcoholes y derivados de benceno; además, recientemente se demostró que el uso de una tecnología innovadora de RMN «no pudo demostrar la correlación entre el contenido de H y la prueba de citotoxicidad in vitro en las líneas celulares ARPE-19 y BALB/3T3«. Sin embargo, debe reconocerse que el grupo de investigación de Menz admitió que «el artículo es la primera contribución en una serie planificada de publicaciones destinadas a proporcionar instrumentos adecuados para garantizar la seguridad del paciente en la aplicación oftalmológica de perfluorocarbonos líquidos (PFCL)«.

La prueba de citotoxicidad in vitro por método de contacto directo en la línea celular epitelial de pigmento retiniano humano (ARPE-19) de acuerdo con las recomendaciones del estándar ISO 10993-5 está ganando un interés creciente.

Cabe señalar que el método de contacto directo es, entre todas las metodologías recomendadas por la norma ISO 10993-5, altamente sensible y capaz de detectar incluso la citotoxicidad débil. Además, como establece la norma ISO, la aplicación del PFCL directamente en la línea celular epitelial de pigmento retiniano humano (ARPE-19) es, tanto como sea posible, similar a la situación clínica en la que se utiliza el producto. En cambio, otras pruebas incluidas en la ISO 10993-5, como el método de extracto, no obedecen a este requisito y son mucho menos sensibles para probar sustancias volátiles e inmiscibles en agua como los PFCL: de hecho, en el pasado el uso del método de extracto condujo a resultados falsamente negativos, con los conocidos malos resultados clínicos en pacientes españoles.

Ciertamente, por todas las razones mencionadas anteriormente, dos grupos de investigación, el grupo de investigación de Srivastava del Instituto IOBA (Instituto Universitario de Oftalmobiología Aplicada, España) y el equipo de investigadores de Alchilife Srl (Italia), en colaboración con Mario Romano, PhD, de la Universidad Humanitas de Milano (Italia), han dedicado un gran esfuerzo a afinar métodos confiables de contacto directo. De hecho, este enfoque requiere pocos pasos técnicos, aunque muy importantes, que están estrictamente relacionados con las especificaciones físico-químicas de los PFCL y son cruciales para validar el método de contacto directo. Si, por un lado, las propiedades de alta densidad de estos compuestos ayudan a evitar la evaporación de la muestra o la pérdida de contacto con las células, por el otro pueden dar lugar a un área de contacto y tiempo de contacto insuficientes entre la muestra y la capa celular, mortalidad celular inducida por pesadez de la muestra y sensibilidad celular inapropiada. Por lo tanto, se debe realizar una evaluación cuidadosa de todos los riesgos de posible falla de la prueba de contacto directo.

Todos estos requisitos se cumplieron por los dos grupos de investigación y cada uno de ellos propuso su método validado:

• En un artículo publicado en IOVS (2018), Srivastava et al. comentaron que su estudio sobre las líneas celulares ARPE-19 y fibroblastos L929de ratón «sugiere aplicar este nuevo método para evitar la aparición de tales casos de ceguera«;
• En su presentación en el 18º Congreso de Euretina en Viena, M. Romano afirmó que «La prueba de citotoxicidad por contacto directo de acuerdo con la ISO 10993-5 es un método adecuado para detectar la citotoxicidad de PFCL y que fue validado utilizando un enfoque cuantitativo y cualitativo en las células ARPE-19 y BALB/3T3 ”. Esta presentación es de particular relevancia para Alchimia, ya que el método descrito es lo que siempre se ha utilizado para probar sus PFCL, como se muestra en las etiquetas de los productos terminados.

Concluyamos con algunas consideraciones:

• Aunque hasta ahora no se ha establecido un método de evaluación uniforme o una evaluación de prueba de citotoxicidad, algunos métodos de prueba de citotoxicidad verdaderamente confiables están disponibles en la literatura, lo que podría ayudar a superar las preocupaciones de seguridad del cirujano sobre el uso de PFCL en la cirugía vitreorretiniana;
• Un control más eficiente por parte de las Autoridades de la Unión Europea es bienvenido, pero falta;
• Incluso las pruebas de citotoxicidad más confiables deben ir acompañadas de pruebas químico-físicas muy completas y precisas para garantizar la máxima pureza de PFCL.

Referencias bibliográficas

• Pastor JC et al. Acute retinal damage after using a toxic perfluorooctane for vitreo-retinal surgery.
  Retina 2017;1440–1151
• Menz DH, et al. How to ward off retinal toxicity of perfluorooctane and other perfluorocarbon liquids?
  Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018; 59:4841–4846
• Srivastava GK et al. Chemical considerations regarding the H-value methodology and its relation with toxicity determination.
  Invest Ophtahalmol Vis Sci 2019; 60:3363-3364
• Ruzza P et al. H‐content is not predictive of perfluorocarbon ocular endotamponade cytotoxicity in vitro.
  ACS Omega 2019 https://doi.org/10.1021/acsomega.9b01793
• Menz DH et al. Author Response: Chemical Considerations Regarding the H-Value Methodology and Its Relation With Toxicity Determination.
  Invest Ophthalmol Vis Sci 2019;60(10):3365-3367
• ISO 10993-5, 2009. Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity.
• Romano M. et al. Evaluation of cytotoxicity of perfluorocarbons for intraocular use by cytotoxicity test in vitro in cell lines and human donor retina ex vivo. Trans Vis Sci Technol 2019, in press.
• Srivastava GK et al. Comparison between direct contact and extract exposure methods for PFO cytotoxicity evaluation.
  Sci Rep 2018;8(1):1425