La investigación involucrada en el campo de la oftalmología, especialmente cuando se centra en las pruebas y en el desarrollo de productos sanitarios o procedimientos médicos que pueden tener un impacto en la salud del endotelio corneal, requiere una gran cantidad de investigaciones, que a veces tienen que enfrentar algunas dificultades técnicas.

Como ejemplo, el uso de córneas de donantes para fines de investigación no es ético, ya que son necesarias para el trasplante Afortunadamente, algunos modelos animales, como el ojo porcino, tienen propiedades anatómicas y fisiológicas bastante similares al ojo humano y, por lo tanto, son alternativas útiles a los tejidos donantes para realizar valiosas investigaciones.

Otra cuestión importante está relacionada con el método utilizado para recopilar y analizar todos los datos de imágenes cualitativas y cuantitativas. En Europa, el método más común para evaluar la viabilidad del endotelio corneal se basa en la tinción con azul de tripano y la evaluación visual de las zonas de mortalidad mediante microscopía óptica. Sin embargo, este método se realiza manualmente y, por lo tanto, la variabilidad del análisis de datos dependiente del operador puede ser un problema, especialmente cuando se considera el número cada vez mayor de análisis que se realizarán.

Para superar este problema, el equipo de I+D de Alchimia desarrolló un método estandarizado para el análisis cuantitativo de la mortalidad de las células endoteliales con una tecnología de microscopía semiautomática a través del software Fiji ImageJ, diseñado específicamente para ayudar a los investigadores en el análisis de las imágenes biológicas.

El primer paso de este método es la preparación del botón corneal del globo ocular porcino y la tinción del endotelio corneal con el azul de tripano. Posteriormente, el tejido teñido se mantiene bajo el microscopio óptico y se analiza utilizando el aumento más apropiado. En esta fase, una cámara conectada con el microscopio puede tomar una serie de imágenes del endotelio corneal. Estas imágenes luego se «transfieren» al software Fiji ImageJ que, mediante el uso de técnicas especiales para optimizar las imágenes corneales (por ejemplo, el endotelio corneal no es un tejido homogéneo y plano), puede emitir imágenes claras del área central central de 8 mm (que corresponde al botón corneal generalmente trasplantado). Dentro de esta área, el software detecta la presencia del píxel azul, correspondiente a las células muertas, y calcula el porcentaje de mortalidad de las células endoteliales en comparación con la cantidad total de células endoteliales.

Este método fue validado utilizando controles negativos (tejidos corneales sanos) y positivos (tejidos corneales muy dañados por sustancias tóxicas).

En conclusión, este sistema cuantitativo semiautomático para la medición de la mortalidad por EC corneal resultó efectivo, estandarizado y reproducible.

Para nosotros, esto significa una herramienta sencilla para realizar un primer examen de los tejidos corneales para comparar diferentes condiciones de conservación corneal y la investigación experimental sobre los tejidos corneales. Además, cuando se usa en productos ya disponibles comercialmente, este método también servirá como una evaluación de seguridad posterior a la comercialización.

Referencias:

  • Giurgola L. et al. Development of a quantitative method to determine corneal endothelial cell mortality. Presentation at the European Associations of Tissue Banks (EATB), 2018
  • Wenzel DA et al. A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons. J Vis Exp 2019;152.
  • Guduric-Fuchs J et al. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis 2009; 15:1915:1928