La ricerca nel campo dell’oftalmologia, specialmente quando focalizzata sui test e sullo sviluppo di dispositivi o procedure mediche che possono avere un impatto sulla salute dell’endotelio corneale, richiede un gran numero di indagini, che a volte affrontano alcune difficoltà tecniche.

Ad esempio, l’uso a scopo di ricerca di cornee espiantate da donatori non è etico, in quanto sono necessarie per il trapianto. Fortunatamente, alcuni modelli animali, come l’occhio suino, hanno proprietà anatomiche e fisiologiche abbastanza simili all’occhio umano e quindi sono valide alternative ai tessuti corneali umani per svolgere ricerche preziose.

Un’altra questione importante riguarda il metodo utilizzato per la raccolta e l’analisi di tutti i dati qualitativi e quantitativi delle immagini. In Europa, il metodo più comune per valutare la vitalità dell’endotelio corneale si basa sulla colorazione con trypan blue e sulla valutazione visiva delle zone di mortalità mediante microscopia ottica. Tuttavia, questo metodo viene eseguito manualmente e, pertanto, la variabilità dell’analisi dei dati, dipendente dall’operatore, può essere un problema, soprattutto se si considera il numero sempre crescente di analisi da eseguire.

Per ovviare a questo problema, il team di Ricerca e Sviluppo di Alchimia ha sviluppato un metodo standardizzato per l’analisi quantitativa della mortalità delle cellule endoteliali con una tecnologia di microscopia semi-automatizzata attraverso il software Fiji ImageJ, appositamente progettato per aiutare i ricercatori nell’analisi delle immagini biologiche.

La prima fase di questo metodo è la preparazione del bottone corneale dal globo oculare suino e la colorazione dell’endotelio corneale con il trypan blue. Successivamente, il tessuto colorato viene posizionato sotto al microscopio ottico e analizzato utilizzando l’ingrandimento più appropriato. A questo punto, una fotocamera collegata al microscopio può scattare una serie di immagini dell’endotelio corneale. Queste immagini vengono quindi “trasferite” al software Fiji ImageJ che, utilizzando speciali tecniche per ottimizzare le immagini corneali (ad esempio: l’endotelio corneale non è un tessuto omogeneo e piatto), può rilasciare immagini nitide dell’area centrale di 8 mm (che corrisponde al bottone corneale solitamente trapiantato). All’interno di quest’area, il software rileva la presenza di pixel blu, corrispondenti alle cellule morte, e calcola la percentuale di mortalità delle cellule endoteliali rispetto alla quantità totale di cellule endoteliali.

Questo metodo è stato validato usando controlli negativi (tessuti corneali sani) e positivi (tessuti corneali gravemente danneggiati da sostanze tossiche).

In conclusione, questo sistema quantitativo semi-automatizzato per la misurazione della mortalità corneale delle cellule endoteliali è risultato efficace, standardizzato e riproducibile.

Per noi, questo significa uno strumento semplice per eseguire un primo screening dei tessuti corneali per confrontare le diverse condizioni di conservazione corneale e la ricerca sperimentale sui tessuti corneali. Inoltre, se utilizzato su prodotti già disponibili in commercio, questo metodo servirà anche come valutazione di sicurezza post-commercializzazione.

Riferimenti:

  • Giurgola L. et al. Development of a quantitative method to determine corneal endothelial cell mortality. Presentation at the European Associations of Tissue Banks (EATB), 2018
  • Wenzel DA et al. A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons. J Vis Exp 2019;152.
  • Guduric-Fuchs J et al. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis 2009; 15:1915:1928