La ricerca di un test di citotossicità veramente affidabile sui perfluorocarburi liquidi (PFCL) sta diventando uno degli argomenti più “caldi” in chirurgia vitreoretinica.

A partire dagli eventi avversi occorsi nel corso degli ultimi anni a causa dell’utilizzo di alcuni perfluorocarburi che solo dopo il loro utilizzo si sono rivelati estremamente tossici per i pazienti, i chirurghi hanno bisogno di essere rassicurati sul fatto che questi incidenti non si ripeteranno. Proprio con questo obiettivo, i produttori di perfluorocarburi si stanno impegnando molto seriamente a fare del proprio meglio per fornire ai chirurghi evidenze solide sulla sicurezza dei loro prodotti.

È oramai accertato che i PFCL completamente fluorurati e non reattivi come PFO (perfluoro-n-ottano) e PFD (perfluorodecalina) non sono tossici in quanto tali; pertanto, tutti gli sforzi nella ricerca si stanno al momento concentrando sulla ricerca del metodo più efficace per rilevare o, più correttamente, escludere la presenza di impurità responsabili di fenomeni di tossicità oculare.

Tuttavia, la letteratura recente in questo campo dimostra chiaramente che l’argomento è ancora oggetto di grande dibattito e che di fatto manca un accordo globale in questo campo.

Attualmente, sono due gli approcci sotto i riflettori: la determinazione del cosiddetto “H-value”, e i test di citotossicità in vitro che utilizzano metodi per contatto diretto.

Il gruppo di ricerca di Menz proveniente da Pharmpur Gmbh, nell’evidenziare la rilevanza clinica dell’H-value, definito come la quantità di composti reattivi non completamente fluorurati nei PFCL, ha proposto che “H-value è una misura delle impurezze reattive e non completamente fluorurate, che causano tossicità nei PFCL, e dovrebbe essere inclusa nelle specifiche di ciascun PFCL; il limite massimo di 10 ppm dimostrerebbe che il processo di ultrapurificazione di un PFCL è stato efficace e che il prodotto è sicuro”. La proposta si basava sulle “evidenze che […] I sottoprodotti non completamente fluorurati che inevitabilmente si formano nel corso dei processi produttivi e si dissolvono nei PFCL possono, anche in quantità minime, portare occasionalmente a gravi reazioni tossiche” e che “la reattività dei composti non completamente fluorurati e la loro tossicità sono strettamente correlate”.

I dubbi sorti sul metodo di determinazione dell’H-value includevano, tra le altre cose, la sua capacità di rilevare solo specifici composti non completamente fluorurati del tipo RFRH (cioè con legami C-H reattivi), lasciando così non quantificabili altre sostanze potenzialmente tossiche – che sono stati identificate nel tristemente noto prodotto usato in Spagna e risultato poi tossico – come acidi, alcoli e derivati ​​del benzene; inoltre, è stato recentemente evidenziato come l’utilizzo di una tecnologia NMR innovativa abbia permesso di dimostrare “che non esiste correlazione tra il contenuto di H e il test di citotossicità in vitro eseguito nelle linee cellulari ARPE-19 e BALB/3T3″. Tuttavia, si deve riconoscere che il gruppo di ricerca di Menz ha ammesso che “l’articolo è il primo contributo che si inserisce all’interno di una serie pianificata di pubblicazioni volte a fornire strumenti adatti a garantire la sicurezza dei pazienti nell’utilizzo dei liquidi perfluoro-carbonici (PFCL) in campo oftalmico”.

È per questo motivo che sta acquisendo sempre maggiore interesse il test di citotossicità in vitro mediante metodo per contatto diretto condotto sulle cellule della linea retinica umana ARPE-19 secondo le raccomandazioni ISO 10993-5.

Va data evidenza che il metodo per contatto diretto è, tra tutte le metodologie raccomandate dalla normativa ISO 10993-5, altamente sensibile e in grado di rilevare anche un livello di citotossicità debole. Inoltre, come affermato dalla stessa ISO, l’apposizione del PFCL direttamente su cellule della linea retinica umana ARPE-19 si avvicina, per quanto possibile, alla situazione clinica in cui verrà utilizzato il prodotto. Invece, altri test descritti nella ISO 10993-5, come ad esempio il metodo per estrazione, non obbediscono a questo requisito e sono molto meno sensibili nel testare le sostanze volatili e insolubili in ambiente acquoso come sono di fatto i PFCL: anzi, in passato l’uso del metodo per estrazione ha portato addirittura a risultati falsamente negativi e, come noto, a pessimi risultati clinici nei pazienti spagnoli.

È certamente per tutte le ragioni sopra menzionate che due gruppi di ricerca, il gruppo di ricerca di Srivastava dell’Istituto IOBA (Instituto Universitario de Oftalmobiología Aplicada, Spagna) e il team di ricercatori di Alchilife Srl (Italia), in collaborazione con il Dr Mario Romano dell’Università Humanitas di Milano, hanno dedicato un grande sforzo nella messa a punto di metodi per contatto diretto realmente affidabili. In realtà, questo approccio richiede pochi, ma molto importanti, passaggi tecnici strettamente correlati alle caratteristiche fisico-chimiche dei PFCL e cruciali per la convalida del metodo per contatto diretto. Se, da un lato, le proprietà legate all’alta densità di questi composti aiutano ad evitare l’evaporazione del campione o la perdita di contatto con le cellule, dall’altro possono portare a una pericolosa riduzione dell’area e del tempo di contatto tra il campione e lo strato cellulare, a mortalità cellulare indotta dalla pesantezza del campione e a una “erronea” sensibilità delle cellule. Pertanto, deve essere eseguita un’attenta valutazione di tutti i rischi che possano portare ad un possibile fallimento del test per contatto diretto.

Tutti questi requisiti sono stati soddisfatti dai due gruppi di ricerca e ciascuno di loro ha proposto il proprio metodo validato:

• In un articolo pubblicato su IOVS (2018), Srivastava et al. ha commentato che il loro studio sulle linee cellulari ARPE-19 e su colture di fibroblasti di topo L929 “suggerisce di applicare questo nuovo metodo per evitare il verificarsi dei noti casi di cecità“;
• Nella sua presentazione alla 18° edizione del Congresso Euretina a Vienna, M. Romano ha affermato che “Il test di citotossicità (proposto, N.d.R;) per contatto diretto secondo ISO 10993-5 è un metodo adatto per rilevare la citotossicità nei PFCL ed è stato validato usando un approccio sia quantitativo che qualitativo nelle linee cellulari ARPE-19 e BALB/3T3.” Questa presentazione è di particolare rilevanza per Alchimia, poiché il metodo descritto è quello che è sempre stato utilizzato per testare i propri perfluorocarburi, come evidenziato all’interno delle etichette dei prodotti finiti.

Concludiamo con queste poche considerazioni:

• Sebbene finora non sia stato stabilito un metodo uniforme per la valutazione della tossicità dei PFCL, alcuni test di citotossicità veramente affidabili stanno diventando disponibili in letteratura, il che potrebbe aiutare a superare le preoccupazioni legate all’utilizzo dei PFCL in chirurgia vitreoretinica da parte del chirurgo;
• Un controllo più accurato da parte delle autorità dell’Unione europea è sia opportuno, sia benvenuto, ma al momento manca;
• Anche i test di citotossicità più affidabili devono essere accompagnati da test chimico-fisici molto accurati per poter garantire la massima purezza dei PFCL.

Referenze bibliografiche

• Pastor JC et al. Acute retinal damage after using a toxic perfluorooctane for vitreo-retinal surgery.
  Retina 2017;1440–1151
• Menz DH, et al. How to ward off retinal toxicity of perfluorooctane and other perfluorocarbon liquids?
  Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018; 59:4841–4846
• Srivastava GK et al. Chemical considerations regarding the H-value methodology and its relation with toxicity determination.
  Invest Ophtahalmol Vis Sci 2019; 60:3363-3364
• Ruzza P et al. H‐content is not predictive of perfluorocarbon ocular endotamponade cytotoxicity in vitro.
  ACS Omega 2019 https://doi.org/10.1021/acsomega.9b01793
• Menz DH et al. Author Response: Chemical Considerations Regarding the H-Value Methodology and Its Relation With Toxicity Determination.
  Invest Ophthalmol Vis Sci 2019;60(10):3365-3367
• ISO 10993-5, 2009. Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity.
• Romano M. et al. Evaluation of cytotoxicity of perfluorocarbons for intraocular use by cytotoxicity test in vitro in cell lines and human donor retina ex vivo. Trans Vis Sci Technol 2019, in press.
• Srivastava GK et al. Comparison between direct contact and extract exposure methods for PFO cytotoxicity evaluation.
  Sci Rep 2018;8(1):1425